2 × Pfu PCR mješavina

Predložak A-1

■ Predložak sadrži proteinske nečistoće ili inhibitore Taq, itd. - Očistite predložak DNK, uklonite proteinske nečistoće ili ekstrahirajte predložak DNA pomoću setova za pročišćavanje.

■ Denaturacija šablone nije dovršena —— Prikladno povećajte temperaturu denaturacije i produljite vrijeme denaturacije.

■ Degradacija predloška ——Ponovo pripremite predložak.

A-2 Primer

■ Loša kvaliteta temeljnih premaza-Ponovno sintetizirajte temeljni premaz.

■ Razgradnja temeljnog premaza —— Podijelite prajmere velike koncentracije u mali volumen radi očuvanja. Izbjegavajte višestruko zamrzavanje i odmrzavanje ili dugotrajno krio konzerviranje na 4 ° C.

■ Nepravilno oblikovanje temeljnih premaza (npr. Duljina temeljnog premaza nije dovoljna, dimer se formira između temeljnih premaza itd.)

A-3 mg²⁺koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg²⁺ koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-4 Temperatura žarenja

■ Visoka temperatura žarenja utječe na vezivanje temeljnog premaza i šablone. ——Smanjite temperaturu žarenja i optimizirajte stanje s gradijentom od 2 ° C.

A-5 Vrijeme produženja

■ Kratko vrijeme produženja —— Produžite vrijeme produženja.

Fenomeni: Negativni uzorci također pokazuju trake ciljnog niza.

A-1 Kontaminacija PCR-om

■ Unakrsna kontaminacija ciljane sekvence ili produkata amplifikacije —— Pažljivo ne pipetirajte uzorak koji sadrži ciljnu sekvencu u negativni uzorak ili ih prosipajte iz epruvete za centrifugiranje. Reagense ili opremu treba autoklavirati radi uklanjanja postojećih nukleinskih kiselina, a postojanje kontaminacije treba utvrditi eksperimentima s negativnom kontrolom.

■ Kontaminacija reagensa —— Raspršite reagense i čuvajte na niskoj temperaturi.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg²⁺ koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

■ Neispravan dizajn temeljnog premaza, a ciljna sekvenca ima homologiju s neciljanom sekvencom. —— Premazi za ponovno oblikovanje.

Fenomeni: PCR amplifikacijske trake nisu u skladu s očekivanom veličinom, bilo velike ili male, ili se ponekad pojavljuju i specifične pojačane pojaseve i nespecifične pojačane pojaseve.

A-1 Primer

■ Loša specifičnost temeljnog premaza

—— Premaz za ponovno oblikovanje.

■ Koncentracija temeljnog premaza je previsoka —— Pravilno povećajte temperaturu denaturacije i produljite vrijeme denaturacije.

A-2 mg²⁺ koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite koncentraciju Mg2+: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-3 Termostabilna polimeraza

■ Prekomjerna količina enzima —— Smanjite količinu enzima na odgovarajući način u intervalima od 0,5 U.

A-4 Temperatura žarenja

■ Temperatura žarenja je preniska-prikladno povećajte temperaturu žarenja ili usvojite dvostupanjsku metodu žarenja

A-5 PCR ciklusi

■ Previše ciklusa PCR -a - Smanjite broj ciklusa PCR -a.

A-1 Primer—— Loša specifičnost —— Preoblikovati temeljni premaz, promijeniti položaj i dužinu temeljnog premaza kako bi se poboljšala njegova specifičnost; ili izvesti ugniježđeni PCR.

A-2 Predložak DNK

—— Predložak nije čist—— Očistite predložak ili ekstrahirajte DNA kompletima za pročišćavanje.

A-3 mg²⁺ koncentracija

——Mg²⁺ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite Mg²⁺ koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-4 dNTP

—— Koncentracija dNTP -a je previsoka —— Skladno smanjite koncentraciju dNTP -a

A-5 Temperatura žarenja

—— Preniska temperatura žarenja —— Prikladno povećajte temperaturu žarenja

Ciklusi A-6

—— Previše ciklusa ——Optimizirajte broj ciklusa

Prvi korak je odabir odgovarajuće polimeraze. Obična Taq polimeraza ne može se lektirati zbog nedostatka 3'-5 'egzonukleazne aktivnosti, a neusklađenost će uvelike smanjiti učinkovitost produženja fragmenata. Stoga obična Taq polimeraza ne može učinkovito pojačati ciljane fragmente veće od 5 kb. Taq polimerazu sa posebnom modifikacijom ili drugu polimerazu visoke vjernosti treba odabrati kako bi se poboljšala učinkovitost produženja i zadovoljile potrebe pojačanja s dugim fragmentima. Osim toga, pojačavanje dugih fragmenata također zahtijeva odgovarajuću prilagodbu dizajna temeljnog premaza, vrijeme denaturacije, vrijeme produženja, pH pufera itd. Obično, temeljni premazi s 18-24 bp mogu dovesti do boljeg prinosa. Kako bi se spriječilo oštećenje šablona, ​​vrijeme denaturacije pri 94 ° C treba smanjiti na 30 sekundi ili manje po ciklusu, a vrijeme za povećanje temperature na 94 ° C prije pojačanja treba biti manje od 1 minute. Štoviše, postavljanje temperature produženja na oko 68 ° C i projektiranje vremena produženja prema brzini od 1 kb/min može osigurati učinkovito pojačanje dugih fragmenata.

Stopa pogrešaka amplifikacije PCR -a može se smanjiti upotrebom različitih DNA polimeraza visoke vjernosti. Među svim dosad pronađenim Taq DNA polimerazama, Pfu enzim ima najmanju stopu pogrešaka i najveću vjernost (vidi priloženu tablicu). Osim odabira enzima, istraživači mogu dodatno smanjiti brzinu mutacije PCR -a optimiziranjem reakcijskih uvjeta, uključujući optimiziranje sastava pufera, koncentraciju termostabilne polimeraze i optimiziranje broja ciklusa PCR -a.