Blood Direct PCR Kit

Brzo pojačavanje ciljnog gena izravno pomoću krvi kao uzorka bez ekstrakcije.

Ovaj komplet usvaja genetski modificiranu anti-inhibitornu DNA polimerazu za učinkovito pojačavanje gena za jednu kopiju u ljudskom genomu. Dobro optimiziran puferski sustav u ovom kompletu pomaže polimerazi da se snažno odupre inhibiciji PCR inhibitora, stoga može izravno pojačati DNA koristeći krv i uzgojene stanice kao šablone. Ovaj proizvod je jednostavan za rukovanje i ne zahtijeva složene korake poput čišćenja DNA ili predtretmana uzoraka.
Ovaj komplet se isporučuje kao 2 × MasterMix, a reakcija se može izvesti jednostavnim dodavanjem uzorka krvi i odgovarajućih detekcijskih primera. Može se primijeniti na uzgojene stanice sisavaca kao što su ljudi, miševi, svinje, goveda i druge vrste, kao i na svježu ili 4 ℃ krioprezerviranu punu krv, antikoagulant (EDTA, citrat, heparin), ukapljene krvne ugruške i suhe krvne mrlje pohranjene na komercijalnim karticama Whatman 903 i FTA Elute.

Mačka. Ne	Veličina pakiranja
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

Pošaljite nam e -poruku

Detalji o proizvodu

Eksperimentalni primjer

Pitanja

Oznake proizvoda

Značajke

■ Jednostavno i brzo: PCR amplifikacija može se izravno izvesti pomoću krvi kao uzorka, bez potrebe za mučnim koracima pripreme uzorka i ekstrakcije DNA.
■ Visoka čistoća: Preskakanje koraka prethodne obrade uzorka i ekstrakcije DNA može pomoći u izbjegavanju unakrsne kontaminacije uzoraka.
■ Velika propusnost: PCR identifikacija za velike uzorke može se izvesti kombiniranjem kompleta s PCR pločama sa 96/384 jažica.
■ Snažna univerzalnost: Ovaj komplet može učinkovito pojačati fragmente visokog GC -a ili fragmente sa složenom sekundarnom strukturom, a duljina pojačanja može biti do 5 kb.
■ Snažna otpornost na stres: Ovaj se komplet može primijeniti na različite vrste i uzorke krvi sačuvane na različite načine.

Prijave

PCR proizvodi ovog kompleta sadrže "A" na 3′-kraju, koji se može izravno koristiti za kloniranje TA vektora. Ovaj se komplet može koristiti za amplifikaciju genomskih fragmenata DNA, genetičku analizu velike produktivnosti i analizu genotipizacije (kao što je otkrivanje gena).

Svi se proizvodi mogu prilagoditi za ODM/OEM. Za detalje,kliknite Prilagođena usluga (ODM/OEM)

Prethodno: TIANcombi DNA Lyse & Det PCR komplet

Sljedeći: Komplet za izravni PCR miša za tkiva

	Koristeći humanu EDTA antikoagulaciju kao predložak, 4 gena s različitim sadržajem GC -a amplificirana su pomoću Direct Direct PCR Kit. Reakcijski sustav PCR bio je 20 μl, a 1 μl krvi upotrijebljeno je kao predložak. M: TIANGEN Marker II; 1: Veličina fragmenta 1090 bp, sadržaj GC 68,1%; 2: Veličina fragmenta 1915 bp, sadržaj GC 70,4%; 3: Veličina fragmenta 448 bp, sadržaj GC 74,8%; 4: Veličina fragmenta 1527 bp, sadržaj GC 61,5%. Eksperimentalni rezultati: Blood Direct PCR Kit može učinkovito pojačati fragmente DNA sa sadržajem GC-a u rasponu od 61,5%-74,8%, što sugerira da je sposoban pojačati fragmente visokog GC-a.
	Koristeći humanu EDTA antikoagulaciju kao predložak, 5 gena različite duljine (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 i Hn4.0) je amplificirano pomoću Blood Direct PCR Kit. Reakcijski sustav PCR bio je 20 μl, a 1 μl krvi upotrijebljeno je kao predložak. M: TIANGEN Marker II; 1-3: 3 različita uzorka krvi; NTC: upravljanje bez temeljnih premaza. Eksperimentalni rezultati: Blood Direct PCR Kit može pojačati fragmente duljine čak 4 kb, što sugerira da je sposoban pojačati duge fragmente.
	Koristeći humanu EDTA antikoagulaciju kao predložak, Blood Direct PCR Kit je korišten za PCR detekciju različitih uzoraka krvi. Reakcijski sustav PCR bio je 20 μl, a 1 μl krvi upotrijebljeno je kao predložak. M: TIANGEN Marker II; 1-9: količina punjenja krvi je 0,1 μl, 0,2 μl, 0,3 μl, 0,4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl i 5 μl, respektivno; NTC: kontrola bez predloška Eksperimentalni rezultati: Blood Direct PCR Kit ima jaku otpornost na krv i može pojačati uzorke krvi s rasponom opterećenja od 0,1-5 μl.
	Kao uzorci korišteni su uzorci krvi ljudi, štakora, piletine i drugih vrsta s različitim tretmanima. Blood Direct PCR Kit korišten je za amplifikaciju PRNP (humani, 750 bp), Actin (štakor, 200 bp) i β-Actin (piletina, 1,0 kb). Reakcijski sustav PCR bio je 20 μl, a 1 μl krvi upotrijebljeno je kao predložak. M: TIANGEN Marker II. Eksperimentalni rezultati: Komplet izravne PCR krvi može se primijeniti na širok raspon uzoraka, a izravno otkrivanje PCR -a može se provesti na uzorcima krvi različitih vrsta s različitim tretmanima.

P: Nema pojaseva pojačanja

Predložak A-1

■ Predložak sadrži proteinske nečistoće ili inhibitore Taq, itd. - Očistite predložak DNK, uklonite proteinske nečistoće ili ekstrahirajte predložak DNA pomoću setova za pročišćavanje.

■ Denaturacija šablone nije dovršena —— Prikladno povećajte temperaturu denaturacije i produljite vrijeme denaturacije.

■ Degradacija predloška ——Ponovo pripremite predložak.

A-2 Primer

■ Loša kvaliteta temeljnih premaza-Ponovno sintetizirajte temeljni premaz.

■ Razgradnja temeljnog premaza —— Podijelite prajmere velike koncentracije u mali volumen radi očuvanja. Izbjegavajte višestruko zamrzavanje i odmrzavanje ili dugotrajno krio konzerviranje na 4 ° C.

■ Nepravilno oblikovanje temeljnih premaza (npr. Duljina temeljnog premaza nije dovoljna, nastaje dimer između temeljnih premaza itd.)

A-3 mg²⁺koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg²⁺koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-4 Temperatura žarenja

■ Visoka temperatura žarenja utječe na vezivanje temeljnog premaza i šablone. ——Smanjite temperaturu žarenja i optimizirajte stanje s gradijentom od 2 ° C.

A-5 Vrijeme produženja

■ Kratko vrijeme produženja —— Produžite vrijeme produženja.

P: Lažno pozitivno

Fenomeni: Negativni uzorci također pokazuju trake ciljnog niza.

A-1 Kontaminacija PCR-om

■ Unakrsna kontaminacija ciljane sekvence ili produkata amplifikacije —— Pažljivo ne pipetirajte uzorak koji sadrži ciljnu sekvencu u negativnom uzorku ili ih prosipajte iz epruvete za centrifugiranje. Reagense ili opremu treba autoklavirati radi uklanjanja postojećih nukleinskih kiselina, a postojanje kontaminacije treba utvrditi eksperimentima s negativnom kontrolom.

■ Kontaminacija reagensa —— Raspršite reagense i čuvajte na niskoj temperaturi.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg²⁺ koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

■ Neispravan dizajn temeljnog premaza, a ciljna sekvenca ima homologiju s neciljanom sekvencom. —— Premazi za ponovno oblikovanje.

P: Nespecifično pojačanje

Fenomeni: PCR amplifikacijske trake nisu u skladu s očekivanom veličinom, bilo velike ili male, ili se ponekad pojavljuju i specifične pojačane pojaseve i nespecifične pojačane pojaseve.

A-1 Primer

■ Loša specifičnost temeljnog premaza

—— Premaz za ponovno oblikovanje.

■ Koncentracija temeljnog premaza je previsoka —— Pravilno povećajte temperaturu denaturacije i produljite vrijeme denaturacije.

A-2 mg²⁺ koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite koncentraciju Mg2+: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-3 Termostabilna polimeraza

■ Prekomjerna količina enzima —— Smanjite količinu enzima na odgovarajući način u intervalima od 0,5 U.

A-4 Temperatura žarenja

■ Temperatura žarenja je preniska-prikladno povećajte temperaturu žarenja ili usvojite dvostupanjsku metodu žarenja

A-5 PCR ciklusi

■ Previše ciklusa PCR -a - Smanjite broj ciklusa PCR -a.

P: Zakrpljene ili razmazane trake

A-1 Primer—— Loša specifičnost —— Preoblikovati temeljni premaz, promijeniti položaj i dužinu temeljnog premaza kako bi se poboljšala njegova specifičnost; ili izvesti ugniježđeni PCR.

A-2 Predložak DNK

—— Predložak nije čist—— Očistite predložak ili ekstrahirajte DNA kompletima za pročišćavanje.

A-3 mg²⁺ koncentracija

——Mg²⁺ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite Mg²⁺ koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-4 dNTP

—— Koncentracija dNTP -a je previsoka —— Skladno smanjite koncentraciju dNTP -a

A-5 Temperatura žarenja

—— Preniska temperatura žarenja —— Prikladno povećajte temperaturu žarenja

Ciklusi A-6

—— Previše ciklusa ——Optimizirajte broj ciklusa

P: Koliko šablone DNK treba dodati u reakcijski sustav PCR -a od 50 μl?

P: Kako pojačati dugačke fragmente?

Prvi korak je odabir odgovarajuće polimeraze. Obična Taq polimeraza ne može se lektirati zbog nedostatka 3'-5 'egzonukleazne aktivnosti, a neusklađenost će uvelike smanjiti učinkovitost produženja fragmenata. Stoga obična Taq polimeraza ne može učinkovito pojačati ciljane fragmente veće od 5 kb. Taq polimerazu sa posebnom modifikacijom ili drugu polimerazu visoke vjernosti treba odabrati kako bi se poboljšala učinkovitost produženja i zadovoljile potrebe pojačanja s dugim fragmentima. Osim toga, pojačavanje dugih fragmenata također zahtijeva odgovarajuću prilagodbu dizajna temeljnog premaza, vrijeme denaturacije, vrijeme produženja, pH pufera itd. Obično, temeljni premazi s 18-24 bp mogu dovesti do boljeg prinosa. Kako bi se spriječilo oštećenje šablona, vrijeme denaturacije pri 94 ° C treba smanjiti na 30 sekundi ili manje po ciklusu, a vrijeme za povećanje temperature na 94 ° C prije pojačanja treba biti manje od 1 minute. Štoviše, postavljanje temperature produženja na oko 68 ° C i projektiranje vremena produženja prema brzini od 1 kb/min može osigurati učinkovito pojačanje dugih fragmenata.

P: Kako poboljšati vjernost amplifikacije PCR -a?

Stopa pogrešaka amplifikacije PCR -a može se smanjiti upotrebom različitih DNA polimeraza visoke vjernosti. Među svim dosad pronađenim Taq DNA polimerazama, Pfu enzim ima najmanju stopu pogrešaka i najveću vjernost (vidi priloženu tablicu). Osim odabira enzima, istraživači mogu dodatno smanjiti brzinu mutacije PCR -a optimiziranjem reakcijskih uvjeta, uključujući optimiziranje sastava pufera, koncentraciju termostabilne polimeraze i optimiziranje broja ciklusa PCR -a.

Ovdje napišite svoju poruku i pošaljite nam je