FastKing gDNA Raspršivanje RT SuperMix

A-1 RNA se razgrađuje

—— Pročistite visokokvalitetnu RNA bez onečišćenja. Materijal iz kojeg se ekstrahira RNA trebao bi biti što svježiji kako bi se spriječila razgradnja RNK. Prije RT reakcije analizirati integritet RNA na denaturiranom gelu. Nakon ekstrakcije RNA, treba je pohraniti u 100% formamidu. Ako se koristi inhibitor RNaze, temperatura zagrijavanja trebala bi biti <45 ° C, a pH manji od 8,0, inače će inhibitor osloboditi svu vezanu RNazu. Štoviše, inhibitor RNaze treba dodati u otopine koje sadrže ≥ 0,8 mM DTT.

A-2 RNA sadrži inhibitore reakcija obrnute transkripcije

—— Inhibitori obrnute transkripcije uključuju SDS, EDTA, glicerol, natrijev pirofosfat, spermidin, formamid, gvanidinsku sol itd. Pomiješajte kontrolnu RNA s uzorkom i usporedite prinos s reakcijom kontrolne RNA kako biste provjerili postoji li inhibitor. Operite taloženje RNA sa 70% (v/v) etanola kako biste uklonili inhibitore.

A-3 Nedovoljno žarenje prajmera koji se koristi za sintezu prvog lanca cDNA

—— Utvrdite da je temperatura žarenja prikladna za temeljne premaze korištene u pokusu. Za slučajne heksamere preporučuje se održavanje temperature na 25 ° C 10 minuta prije postizanja temperature reakcije. Za genetski specifične početnike (GSP) pokušajte s drugim GSP-om ili prijeđite na oligo (dT) ili slučajni heksamer.

A-4 Mala količina početne RNK

——Povećajte količinu RNK. Za uzorke RNA manje od 50 ng, 0,1 μg do 0,5 μg acetil BSA može se koristiti u sintezi cDNA prve niti

A-5 Ciljani slijed nije izražen u analiziranim tkivima.

—— Isprobajte druga tkiva.

A-6 PCR reakcija ne uspijeva

——Za dvostupanjski RT-PCR, cDNA šablon u koraku PCR-a ne može premašiti 1/5 reakcijskog volumena.

A-1 Nespecifično žarenje temeljnih premaza i šablona

—— 3'-kraj početnika ne smije sadržavati 2-3 dG ili dC. U sintezi prvog niza upotrijebite genetski specifične primere umjesto slučajnih primera ili oligo (dT). U prvih nekoliko ciklusa koristite višu temperaturu žarenja, a zatim nižu temperaturu žarenja. Upotrijebite Taq DNA polimerazu s vrućim startom za PCR kako biste poboljšali specifičnost reakcije.

A-2 Loš dizajn gena specifičnih prajmera

—— Slijedite iste principe za dizajn primera za pojačavanje.

A-3 RNA kontaminirana genomskom DNA

—— Tretirajte RNA s DNazom razreda PCR. Postavite kontrolnu reakciju bez obrnute transkripcije za otkrivanje kontaminacije DNA.

A-4 Formiranje temeljnog dimera

—— Dizajnirajte početnice bez komplementarnih sekvenci na 3 'kraju.

A-5 Previsoka Mg²⁺ koncentracija

——Optimizujte Mg²⁺ koncentracija za svaku kombinaciju predloška i temeljnog premaza

A-6 Zagađen stranom DNK

—— Koristite vrhove otporne na aerosol i enzime UDG.

A-1 Sadržaj proizvoda prve niti je previsok

—— Smanjite količinu proizvoda prve niti u konvencionalnom koraku PCR reakcije.

A-2 Prevelika količina prajmera u PCR reakciji

——Smanji unos temeljnog premaza.

A-3 Previše ciklusa

——Optimirajte PCR reakcijske uvjete i smanjite broj ciklusa PCR -a.

A-4 Preniska temperatura žarenja

——Povećajte temperaturu žarenja kako biste spriječili nespecifično pokretanje i produženje.

A-5 Nespecifično pojačavanje fragmenata oligonukleotida nastalih razgradnjom DNaze DNK-Izdvojite visokokvalitetnu RNK kako biste spriječili kontaminaciju DNA.

RT-PCR treba obrnuto transkribirati RNA u cDNA, a zatim koristiti reverzno transkribiranu cDNA kao predložak za PCR reakciju za amplifikaciju ciljnog fragmenta. Odaberite bilo slučajne početnike, Oligo dT i gene specifične početnice prema specifičnim uvjetima eksperimenta. Svi gornji početni premazi mogu se koristiti za kratku eRK staničnu mRNA bez strukture ukosnice.

Slučajni primer: Pogodan za dugu RNK sa strukturom ukosnice, kao i sve vrste RNK kao što su rRNA, mRNA, tRNA itd. Uglavnom se koriste za RT-PCR reakciju pojedinačnog uzorka.

Oligo dT: Pogodno za RNK s PolyA repom (prokariotska RNA, eukariotska Oligo dT rRNA i tRNA nemaju PolyA repove). Budući da je Oligo dT vezan za PolyA rep, kvaliteta uzoraka RNA mora biti visoka, pa čak i mala količina razgradnje uvelike će smanjiti količinu sinteze cDNA cijelom dužinom.

Primer specifičan za gen: Komplementaran sa šablonom sekvence, pogodan za situacije u kojima je poznata ciljna sekvenca.

Postoje dva načina:

1. Interna referentna metoda: U teoriji, cDNA su fragmenti DNA različite duljine, pa je rezultat elektroforeze razmaz. Ako je brojnost RNK niska, u elektroforezi se neće pokazati nikakav proizvod, ali to ne znači da niti jedan proizvod neće biti pojačan PCR -om. Općenito, unutarnja referenca može se koristiti za otkrivanje cDNA. Ako unutarnja referenca daje rezultate, kvaliteta cDNA može se u osnovi zajamčiti (u nekoliko slučajeva, ako je fragment ciljnog gena predug, mogu postojati iznimke).

2. Ako postoji poznati gen pojačan ovim predloškom, to se može provjeriti početnicama ovog gena. Pojačanje interne reference ne znači nužno da nema problema s cDNA. Budući da unutarnja referenca ima veliku količinu cDNA, lako ju je pojačati. Ako se cDNA djelomično razgradi iz različitih razloga, iz perspektive vjerojatnosti, rezultati PCR -a ciljanih gena male brojnosti bit će uvelike pogođeni. Iako je internih referenci još uvijek u izobilju, pojačanje vjerojatno neće utjecati.

Djelomično razgradnja RNK. Otkrijte integritet i pročistite RNK

Sadržaj RNA različitih vrsta može biti različit, ali općenito, ekstrahirana ukupna RNA trebala bi sadržavati dvije jasne trake 28S i 18S u elektroforezi u gelu, a svjetlina prve trake trebala bi biti dvostruko veća od one druge. 5S pojas označava da je RNA razgrađena, a njezina svjetlina je proporcionalna stupnju razgradnje. Uspješno pojačavanje interne reference ne znači da nema problema s RNA, jer je unutarnja referenca u velikom broju, RNA se može pojačati sve dok razgradnja nije ozbiljna. OD₂₆₀/OD₂₈₀omjer čiste RNA izmjeren spektrofotometrom trebao bi biti između 1,9 i 2,1. Mala količina proteinske nečistoće u RNA smanjit će omjer. Sve dok vrijednost nije preniska, to neće utjecati na RT. Ono što je najvažnije za RT je integritet RNK.

Proširenje unutarnjeg referentnog gena može samo ukazivati ​​na to da je RT uspjelo, ali nije nužno povezano s kvalitetom lanca cDNA. Budući da su unutarnji referentni fragmenti općenito male veličine i visokog izražaja, lakše je postići uspjeh u obrnutoj transkripciji. Međutim, veličina i ekspresija ciljnog gena razlikuju se od gena do gena. Kvaliteta cDNA ne može se procijeniti samo unutarnjom referencom, posebno za ciljane fragmente dulje od 2 kb.

Neki uzorci imaju složene sekundarne strukture, ili imaju bogat sadržaj GC -a ili su dragocjeni s malom količinom. U tim slučajevima, odgovarajuću reverznu transkriptazu treba odabrati ovisno o veličini ciljnog fragmenta i uzorka. Za šablone RNK s visokim udjelom GC -a i složenom sekundarnom strukturom, teško je otvoriti sekundarnu strukturu na niskoj temperaturi ili s uobičajenom reverznom transkriptazom. Za ove se predloške može odabrati Quant Reverse Transcriptase, budući da je njezina izvedba obrnute transkripcije očito bolja od one reverzne transkriptaze serije M-MLV, koja može učinkovito preokrenuti različite RNA predloške i prepisati RNA u prvi niz cDNA u najvećoj mogućoj mjeri. Kada se koristi opći komplet reverzne transkriptaze, sustav od 20 μl može učinkovito preokrenuti samo 1 μg ukupne RNA. Molimo obratite pozornost na maksimalni RT kapacitet kompleta. Ako se predložak doda u višku, obrnuta transkripcija će favorizirati RNK s velikom količinom. Stoga je bolje ne prelaziti maksimalni kapacitet sustava.

A-1 Utvrditi je li RNA ozbiljno razgrađena i je li RT uspješan

Općenito, razlog neuspjeha internog referentnog pojačanja često je uzrokovan ozbiljnom degradacijom RNA. Drugi mogući razlog je neuspjeh obrnute transkripcije. Interna referenca ne može se koristiti kao standard za procjenu kvalitete cDNA pojedinačne niti, ali se može koristiti kao standard za procjenu je li obrnuta transkripcija uspješna ako nema problema s kvalitetom RNA. Najvažnija stvar u procesu obrnute transkripcije je održavanje konstantne temperature i stalnog reakcijskog sustava kako bi se poboljšala učinkovitost reakcije.

A-2 Utvrdite jesu li primeri za amplifikaciju internih referentnih gena pouzdani i ima li problema s reagensima koji se koriste u PCR-u.

Za relativnu kvantifikaciju, RNA se mora kvantificirati prije obrnute transkripcije, što je također potrebno u mnogim kompletima reverzne transkripcije, na primjer, kvantificirati unos RNA kao 1 μg. Budući da je obrnuto transkribirana cDNA mješovita otopina, uključujući RNK, oligo dT, enzim, dNTP, pa čak i malo ostatka DNA, doći će do odstupanja, pa je nemoguće točno kvantificirati cDNA. Stoga je neophodna kvantifikacija RNK. S obzirom na to da je učinkovitost obrnute transkripcije ista među različitim uzorcima, količina dobivene cDNA trebala bi biti ista, a kvantitativna analiza može pokazati usporedbu razina ekspresije različitih gena u istoj količini ukupne RNA. Prilikom izvođenja relativne fluorescentne kvantitativne PCR, kvantitativna cDNA možda neće biti potrebna nakon obrnute transkripcije jer se unutarnji referentni gen može ponašati kao referentni.

Uglavnom se odnosi na gene, a obrnuta transkripcija dugog fragmenta nije izvediva za većinu gena. Prvo, učinkovitost obrnute transkripcije daleko je niža od PCR -a. Drugo, regija bogata GC -om i sekundarna struktura mnogih gena ograničavaju i obrnutu transkripciju i PCR. Konačno, vjernost i učinkovitost amplifikacije PCR -a teško je jamčiti u isto vrijeme. U procesu obrnute transkripcije nitko ne može garantirati dobivanje dugih fragmenata za gene s niskom kopijom, posebno koristeći oligo dT. Što se tiče 5 'UTR -a s više GC -a, to je još teže. Stoga je još uvijek razumna metoda obrnuti transkript nasumičnim početnicama, pronaći mjesta prirodnog cijepanja u ciljnom fragmentu, pojačati po segmentima, a zatim izvršiti restrikcijsku probavu i ligaciju. Općenito, teško je izravno pojačati fragmente veće od 2 kb, ali nije uvijek nemoguće dobiti: 1. Prije svega, jamčite integritet RNA/mRNA, a poželjna je ekstrakcija TRIZOL -a. 2. M-MLV RT-PCR komplet može se izravno koristiti. Produžite vrijeme žarenja i pravilno povećajte broj ciklusa u procesu pojačanja. Alternativno, može se primijeniti ugniježđeni PCR ili prvo provesti jednu ili dvije reakcije s prikladno produženim vremenom denaturacije i produženja prije normalne PCR amplifikacije, što može pomoći u produljenju fragmenata. Obratite pozornost na vjernost polimeraze. 3. Dugi Taq može se koristiti u PCR -u za postizanje idealnih rezultata. 4. Za primjenu ekspresije proteina treba primijeniti polimerazu visoke vjernosti.

TIANGEN nudi dvije vrste reverzne transkriptaze: Quant/King RTase i TIANScript M-MLV. Glavna razlika između njih je ulazna količina predložaka. Quant je jedinstvena reverzna transkriptaza, koja se razlikuje od uobičajeno korištenog M-MLV-a izvedenog iz virusa Moloney mišje leukemije. Quant je nova visokoučinkovita reverzna transkriptaza rekombinantno izražena inženjeringom Escherichia coli. Quant je pogodan za amplifikaciju 50 ng-2 μg RNA s visokom reverznom transkripcijskom aktivnošću i visokim prinosom. U usporedbi s običnim MMLV -om ili AMV -om, najveća Quantova karakteristika je da ima vrlo snažan afinitet prema RNA predlošcima i može preokrenuti složene predloške transkripta bez denaturacije na visokoj temperaturi. Za predloške s većim sadržajem GC -a, obrnuta učinkovitost je veća. Međutim, ova reverzna transkriptaza ima aktivnost RNaze H, što može utjecati na duljinu cDNA produkta (pogodno za šablone <4,5 kb). Za konvencionalnu obrnutu transkripciju preporučuje se TIANScript MMLV reverzna transkriptaza. Ova RTaza je modificirani enzim sa vrlo slabom aktivnošću RNaze H, koji je pogodan za dugu (> 5 kb) sintezu cDNA.

Obrnuta transkripcija u jednom koraku i PCR amplifikacija dovršeni su u istoj epruveti bez otvaranja poklopca cijevi između sinteze i amplifikacije cDNA, što je korisno za smanjenje kontaminacije. Budući da se svi dobiveni uzorci cDNA koriste za amplifikaciju, osjetljivost je veća, s minimalno 0,01 pg ukupne RNA. Za uspješan RTPCR u jednom koraku, genetski specifični početnici se općenito koriste za pokretanje sinteze cDNA. Dvostupanjska metoda, naime reverzna transkripcija i PCR amplifikacija, provodi se u dva koraka. Prvo se vrši reverzna transkripcija iz RNA predloška kako bi se dobila cDNA, a dobivena cDNA se podvrgava jednoj ili više različitih PCR reakcija. Metoda u dva koraka može koristiti oligo (dT) ili nasumične početnike za usmjeravanje sinteze prvog niza cDNA, te može obrnuto prepisati sve informacije o mRNA iz određenog uzorka.