■ Jednostavno i brzo: PCR amplifikacija može se izravno izvesti pomoću krvi kao uzorka, bez potrebe za mučnim koracima pripreme uzorka i ekstrakcije DNA.
■ Visoka čistoća: Preskakanje koraka prethodne obrade uzorka i ekstrakcije DNA može pomoći u izbjegavanju unakrsne kontaminacije uzoraka.
■ Velika propusnost: PCR identifikacija za velike uzorke može se izvesti kombiniranjem kompleta s PCR pločama sa 96/384 jažica.
■ Snažna univerzalnost: Ovaj komplet može učinkovito pojačati fragmente visokog GC -a ili fragmente sa složenom sekundarnom strukturom, a duljina pojačanja može biti do 5 kb.
■ Snažna otpornost na stres: Ovaj se komplet može primijeniti na različite vrste i uzorke krvi sačuvane na različite načine.
PCR proizvodi ovog kompleta sadrže "A" na 3′-kraju, koji se može izravno koristiti za kloniranje TA vektora. Ovaj se komplet može koristiti za amplifikaciju genomskih fragmenata DNA, genetičku analizu velike produktivnosti i analizu genotipizacije (kao što je otkrivanje gena).
Svi se proizvodi mogu prilagoditi za ODM/OEM. Za detalje,kliknite Prilagođena usluga (ODM/OEM)
Koristeći humanu EDTA antikoagulaciju kao predložak, 4 gena s različitim sadržajem GC -a amplificirana su pomoću Direct Direct PCR Kit. Reakcijski sustav PCR bio je 20 μl, a 1 μl krvi upotrijebljeno je kao predložak. M: TIANGEN Marker II; 1: Veličina fragmenta 1090 bp, sadržaj GC 68,1%; 2: Veličina fragmenta 1915 bp, sadržaj GC 70,4%; 3: Veličina fragmenta 448 bp, sadržaj GC 74,8%; 4: Veličina fragmenta 1527 bp, sadržaj GC 61,5%. Eksperimentalni rezultati: Blood Direct PCR Kit može učinkovito pojačati fragmente DNA sa sadržajem GC-a u rasponu od 61,5%-74,8%, što sugerira da je sposoban pojačati fragmente visokog GC-a. |
|
Koristeći humanu EDTA antikoagulaciju kao predložak, 5 gena različite duljine (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 i Hn4.0) je amplificirano pomoću Blood Direct PCR Kit. Reakcijski sustav PCR bio je 20 μl, a 1 μl krvi upotrijebljeno je kao predložak. M: TIANGEN Marker II; 1-3: 3 različita uzorka krvi; NTC: upravljanje bez temeljnih premaza. Eksperimentalni rezultati: Blood Direct PCR Kit može pojačati fragmente duljine čak 4 kb, što sugerira da je sposoban pojačati duge fragmente. |
|
Koristeći humanu EDTA antikoagulaciju kao predložak, Blood Direct PCR Kit je korišten za PCR detekciju različitih uzoraka krvi. Reakcijski sustav PCR bio je 20 μl, a 1 μl krvi upotrijebljeno je kao predložak. M: TIANGEN Marker II; 1-9: količina punjenja krvi je 0,1 μl, 0,2 μl, 0,3 μl, 0,4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl i 5 μl, respektivno; NTC: kontrola bez predloška Eksperimentalni rezultati: Blood Direct PCR Kit ima jaku otpornost na krv i može pojačati uzorke krvi s rasponom opterećenja od 0,1-5 μl. |
|
Kao uzorci korišteni su uzorci krvi ljudi, štakora, piletine i drugih vrsta s različitim tretmanima. Blood Direct PCR Kit korišten je za amplifikaciju PRNP (humani, 750 bp), Actin (štakor, 200 bp) i β-Actin (piletina, 1,0 kb). Reakcijski sustav PCR bio je 20 μl, a 1 μl krvi upotrijebljeno je kao predložak. M: TIANGEN Marker II. Eksperimentalni rezultati: Komplet izravne PCR krvi može se primijeniti na širok raspon uzoraka, a izravno otkrivanje PCR -a može se provesti na uzorcima krvi različitih vrsta s različitim tretmanima. |
Predložak A-1
■ Predložak sadrži proteinske nečistoće ili inhibitore Taq, itd. - Očistite predložak DNK, uklonite proteinske nečistoće ili ekstrahirajte predložak DNA pomoću setova za pročišćavanje.
■ Denaturacija šablone nije dovršena —— Prikladno povećajte temperaturu denaturacije i produljite vrijeme denaturacije.
■ Degradacija predloška ——Ponovo pripremite predložak.
A-2 Primer
■ Loša kvaliteta temeljnih premaza-Ponovno sintetizirajte temeljni premaz.
■ Razgradnja temeljnog premaza —— Podijelite prajmere velike koncentracije u mali volumen radi očuvanja. Izbjegavajte višestruko zamrzavanje i odmrzavanje ili dugotrajno krio konzerviranje na 4 ° C.
■ Nepravilno oblikovanje temeljnih premaza (npr. Duljina temeljnog premaza nije dovoljna, nastaje dimer između temeljnih premaza itd.)
A-3 mg2+koncentracija
■ Mg2+ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg2+ koncentracija: Optimizirajte Mg2+ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg2+ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.
A-4 Temperatura žarenja
■ Visoka temperatura žarenja utječe na vezivanje temeljnog premaza i šablone. ——Smanjite temperaturu žarenja i optimizirajte stanje s gradijentom od 2 ° C.
A-5 Vrijeme produženja
■ Kratko vrijeme produženja —— Produžite vrijeme produženja.
Fenomeni: Negativni uzorci također pokazuju trake ciljnog niza.
A-1 Kontaminacija PCR-om
■ Unakrsna kontaminacija ciljane sekvence ili produkata amplifikacije —— Pažljivo ne pipetirajte uzorak koji sadrži ciljnu sekvencu u negativnom uzorku ili ih prosipajte iz epruvete za centrifugiranje. Reagense ili opremu treba autoklavirati radi uklanjanja postojećih nukleinskih kiselina, a postojanje kontaminacije treba utvrditi eksperimentima s negativnom kontrolom.
■ Kontaminacija reagensa —— Raspršite reagense i čuvajte na niskoj temperaturi.
A-2 Primer
■ Mg2+ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg2+ koncentracija: Optimizirajte Mg2+ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg2+ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.
■ Neispravan dizajn temeljnog premaza, a ciljna sekvenca ima homologiju s neciljanom sekvencom. —— Premazi za ponovno oblikovanje.
Fenomeni: PCR amplifikacijske trake nisu u skladu s očekivanom veličinom, bilo velike ili male, ili se ponekad pojavljuju i specifične pojačane pojaseve i nespecifične pojačane pojaseve.
A-1 Primer
■ Loša specifičnost temeljnog premaza
—— Premaz za ponovno oblikovanje.
■ Koncentracija temeljnog premaza je previsoka —— Pravilno povećajte temperaturu denaturacije i produljite vrijeme denaturacije.
A-2 mg2+ koncentracija
■ Mg2+ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite koncentraciju Mg2+: Optimizirajte Mg2+ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg2+ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.
A-3 Termostabilna polimeraza
■ Prekomjerna količina enzima —— Smanjite količinu enzima na odgovarajući način u intervalima od 0,5 U.
A-4 Temperatura žarenja
■ Temperatura žarenja je preniska-prikladno povećajte temperaturu žarenja ili usvojite dvostupanjsku metodu žarenja
A-5 PCR ciklusi
■ Previše ciklusa PCR -a - Smanjite broj ciklusa PCR -a.
A-1 Primer—— Loša specifičnost —— Preoblikovati temeljni premaz, promijeniti položaj i dužinu temeljnog premaza kako bi se poboljšala njegova specifičnost; ili izvesti ugniježđeni PCR.
A-2 Predložak DNK
—— Predložak nije čist—— Očistite predložak ili ekstrahirajte DNA kompletima za pročišćavanje.
A-3 mg2+ koncentracija
——Mg2+ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite Mg2+ koncentracija: Optimizirajte Mg2+ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg2+ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.
A-4 dNTP
—— Koncentracija dNTP -a je previsoka —— Skladno smanjite koncentraciju dNTP -a
A-5 Temperatura žarenja
—— Preniska temperatura žarenja —— Prikladno povećajte temperaturu žarenja
Ciklusi A-6
—— Previše ciklusa ——Optimizirajte broj ciklusa
Prvi korak je odabir odgovarajuće polimeraze. Obična Taq polimeraza ne može se lektirati zbog nedostatka 3'-5 'egzonukleazne aktivnosti, a neusklađenost će uvelike smanjiti učinkovitost produženja fragmenata. Stoga obična Taq polimeraza ne može učinkovito pojačati ciljane fragmente veće od 5 kb. Taq polimerazu sa posebnom modifikacijom ili drugu polimerazu visoke vjernosti treba odabrati kako bi se poboljšala učinkovitost produženja i zadovoljile potrebe pojačanja s dugim fragmentima. Osim toga, pojačavanje dugih fragmenata također zahtijeva odgovarajuću prilagodbu dizajna temeljnog premaza, vrijeme denaturacije, vrijeme produženja, pH pufera itd. Obično, temeljni premazi s 18-24 bp mogu dovesti do boljeg prinosa. Kako bi se spriječilo oštećenje šablona, vrijeme denaturacije pri 94 ° C treba smanjiti na 30 sekundi ili manje po ciklusu, a vrijeme za povećanje temperature na 94 ° C prije pojačanja treba biti manje od 1 minute. Štoviše, postavljanje temperature produženja na oko 68 ° C i projektiranje vremena produženja prema brzini od 1 kb/min može osigurati učinkovito pojačanje dugih fragmenata.
Stopa pogrešaka amplifikacije PCR -a može se smanjiti upotrebom različitih DNA polimeraza visoke vjernosti. Među svim dosad pronađenim Taq DNA polimerazama, Pfu enzim ima najmanju stopu pogrešaka i najveću vjernost (vidi priloženu tablicu). Osim odabira enzima, istraživači mogu dodatno smanjiti brzinu mutacije PCR -a optimiziranjem reakcijskih uvjeta, uključujući optimiziranje sastava pufera, koncentraciju termostabilne polimeraze i optimiziranje broja ciklusa PCR -a.
Naša tvornica od svog osnutka razvija proizvode prve svjetske klase pridržavajući se načela
prvo kvalitete. Naši su proizvodi stekli izvrsnu reputaciju u industriji i vrijedno povjerenje među novim i starim kupcima.