Komplet za izravni PCR miša za tkiva

Brzo pojačavanje ciljnog gena izravno iz uzoraka životinjskog tkiva bez ekstrakcije.

Komplet izravnog PCR -a za mišje tkivo prihvaća jedinstveni dizajn pakiranja koji uključuje sve reagense za brzu pripremu genomske DNA i PCR amplifikaciju. Primjenjivo je za jednostupanjsko pročišćavanje DNK genoma iz miševskih tkiva (rep, uho i prsti na nogama) i naknadnu PCR amplifikaciju i detekciju. Cijeli postupak ne uključuje homogenizaciju, razbijanje, varenje preko noći, ekstrakciju organskog otapala, taloženje etanola ili korake pročišćavanja kolone. Stabilni rezultati mogu se postići jednostavnim i brzim postupcima.

2 × Dir PCR MasterMix koji dolazi iz ovog kompleta visoko je kompatibilan PCR reagens koji može učinkovito i specifično pojačati DNA bez potrebe za uklanjanjem nečistoća kao što su proteini. Ovaj reagens sadrži vrući start modificiran antitijelimaTaq DNA polimeraza, dNTP, MgCl2, pufere, kao i pojačivač, optimizator i stabilizator za PCR reakciju. PCR reakcija može se izvesti jednostavnim dodavanjem grubo ekstrahiranog predloška i specifičnih primera. Cijeli proces je brz, jednostavan, osjetljiv, specifičan i stabilan, što je posebno prikladno za probir velike propusnosti. 2 × Dir PCR MasterMix sadrži premiksnu boju za elektroforezu, tako da se PCR proizvodi mogu izravno poslati na detekciju elektroforeze nakon reakcije. 3 'kraj PCR proizvoda ima A-tailing, koji se može koristiti za kloniranje TA.

Mačka. Ne Veličina pakiranja
4992531 20 µl × 50 rxn
4992532 20 µl × 200 rxn

Detalji o proizvodu

Tijek rada

Eksperimentalni primjer

Pitanja

Oznake proizvoda

Značajke

■ Jednostavno i brzo: Genomska DNA može se brzo izvaditi iz tkiva miša za 60 minuta bez mljevenja tekućeg dušika i ekstrakcije organskog otapala.
■ Široka primjena: Pogodan je za jednofaznu ekstrakciju genomske DNA iz miševa repa, uha, prstiju i drugih tkiva.
■ Visoka specifičnost: Taq polimeraza korištena u ovom proizvodu je enzim za vrući start modificiran protutijelom, s visokim afinitetom prema matrici i prajmeru i specifičnošću pojačanja, što je posebno prikladno za genotipizaciju i transgenu identifikaciju.
■ Otkrivanje gena: Proizvod je jednostavan za rukovanje s pouzdanim rezultatima, a posebno je prikladan za visokopropusnu analizu i detekciju tkiva miša

Svi se proizvodi mogu prilagoditi za ODM/OEM. Za detalje,kliknite Prilagođena usluga (ODM/OEM)


  • Prethodno:
  • Sljedeći:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×

    Workflow

    Experimental Example

    Korištenje Direct PCR kompleta za mišje tkivo i relevantnog proizvoda od dobavljača A za pojačavanje fragmenata od 1000 bp, 2000 bp i 3000 bp iz repa miša, uha miša i repa štakora. Rezultat je pokazao da komplet izravnog PCR kompleta za mišje tkivo ima bolju specifičnost i uspješnost.

    P: Nema pojaseva pojačanja

    Predložak A-1

    ■ Predložak sadrži proteinske nečistoće ili inhibitore Taq, itd. - Očistite predložak DNK, uklonite proteinske nečistoće ili ekstrahirajte predložak DNA pomoću setova za pročišćavanje.

    ■ Denaturacija šablone nije dovršena —— Prikladno povećajte temperaturu denaturacije i produljite vrijeme denaturacije.

    ■ Degradacija predloška ——Ponovo pripremite predložak.

    A-2 Primer

    ■ Loša kvaliteta temeljnih premaza-Ponovno sintetizirajte temeljni premaz.

    ■ Razgradnja temeljnog premaza —— Podijelite prajmere velike koncentracije u mali volumen radi očuvanja. Izbjegavajte višestruko zamrzavanje i odmrzavanje ili dugotrajno krio konzerviranje na 4 ° C.

    ■ Nepravilno oblikovanje temeljnih premaza (npr. Duljina temeljnog premaza nije dovoljna, nastaje dimer između temeljnih premaza itd.)

    A-3 mg2+koncentracija

    ■ Mg2+ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg2+ koncentracija: Optimizirajte Mg2+ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg2+ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

    A-4 Temperatura žarenja

    ■ Visoka temperatura žarenja utječe na vezivanje temeljnog premaza i šablone. ——Smanjite temperaturu žarenja i optimizirajte stanje s gradijentom od 2 ° C.

    A-5 Vrijeme produženja

    ■ Kratko vrijeme produženja —— Produžite vrijeme produženja.

    P: Lažno pozitivno

    Fenomeni: Negativni uzorci također pokazuju trake ciljnog niza.

    A-1 Kontaminacija PCR-om

    ■ Unakrsna kontaminacija ciljane sekvence ili produkata amplifikacije —— Pažljivo ne pipetirajte uzorak koji sadrži ciljnu sekvencu u negativnom uzorku ili ih prosipajte iz epruvete za centrifugiranje. Reagense ili opremu treba autoklavirati radi uklanjanja postojećih nukleinskih kiselina, a postojanje kontaminacije treba utvrditi eksperimentima s negativnom kontrolom.

    ■ Kontaminacija reagensa —— Raspršite reagense i čuvajte na niskoj temperaturi.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg2+ koncentracija: Optimizirajte Mg2+ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg2+ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

    ■ Neispravan dizajn temeljnog premaza, a ciljna sekvenca ima homologiju s neciljanom sekvencom. —— Premazi za ponovno oblikovanje.

    P: Nespecifično pojačanje

    Fenomeni: PCR amplifikacijske trake nisu u skladu s očekivanom veličinom, bilo velike ili male, ili se ponekad pojavljuju i specifične pojačane pojaseve i nespecifične pojačane pojaseve.

    A-1 Primer

    ■ Loša specifičnost temeljnog premaza

    —— Premaz za ponovno oblikovanje.

    ■ Koncentracija temeljnog premaza je previsoka —— Pravilno povećajte temperaturu denaturacije i produljite vrijeme denaturacije.

    A-2 mg2+ koncentracija

    ■ Mg2+ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite koncentraciju Mg2+: Optimizirajte Mg2+ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg2+ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

    A-3 Termostabilna polimeraza

    ■ Prekomjerna količina enzima —— Smanjite količinu enzima na odgovarajući način u intervalima od 0,5 U.

    A-4 Temperatura žarenja

    ■ Temperatura žarenja je preniska-prikladno povećajte temperaturu žarenja ili usvojite dvostupanjsku metodu žarenja

    A-5 PCR ciklusi

    ■ Previše ciklusa PCR -a - Smanjite broj ciklusa PCR -a.

    P: Zakrpljene ili razmazane trake

    A-1 Primer—— Loša specifičnost —— Preoblikovati temeljni premaz, promijeniti položaj i dužinu temeljnog premaza kako bi se poboljšala njegova specifičnost; ili izvesti ugniježđeni PCR.

    A-2 Predložak DNK

    —— Predložak nije čist—— Očistite predložak ili ekstrahirajte DNA kompletima za pročišćavanje.

    A-3 mg2+ koncentracija

    ——Mg2+ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite Mg2+ koncentracija: Optimizirajte Mg2+ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM s intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalne Mg2+ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

    A-4 dNTP

    —— Koncentracija dNTP -a je previsoka —— Skladno smanjite koncentraciju dNTP -a

    A-5 Temperatura žarenja

    —— Preniska temperatura žarenja —— Prikladno povećajte temperaturu žarenja

    Ciklusi A-6

    —— Previše ciklusa ——Optimizirajte broj ciklusa

    P: Koliko šablone DNK treba dodati u reakcijski sustav PCR -a od 50 μl?
    ytry
    P: Kako pojačati dugačke fragmente?

    Prvi korak je odabir odgovarajuće polimeraze. Obična Taq polimeraza ne može se lektirati zbog nedostatka 3'-5 'egzonukleazne aktivnosti, a neusklađenost će uvelike smanjiti učinkovitost produženja fragmenata. Stoga obična Taq polimeraza ne može učinkovito pojačati ciljane fragmente veće od 5 kb. Taq polimerazu sa posebnom modifikacijom ili drugu polimerazu visoke vjernosti treba odabrati kako bi se poboljšala učinkovitost produženja i zadovoljile potrebe pojačanja s dugim fragmentima. Osim toga, pojačavanje dugih fragmenata također zahtijeva odgovarajuću prilagodbu dizajna temeljnog premaza, vrijeme denaturacije, vrijeme produženja, pH pufera itd. Obično, temeljni premazi s 18-24 bp mogu dovesti do boljeg prinosa. Kako bi se spriječilo oštećenje šablona, ​​vrijeme denaturacije pri 94 ° C treba smanjiti na 30 sekundi ili manje po ciklusu, a vrijeme za povećanje temperature na 94 ° C prije pojačanja treba biti manje od 1 minute. Štoviše, postavljanje temperature produženja na oko 68 ° C i projektiranje vremena produženja prema brzini od 1 kb/min može osigurati učinkovito pojačanje dugih fragmenata.

    P: Kako poboljšati vjernost amplifikacije PCR -a?

    Stopa pogrešaka amplifikacije PCR -a može se smanjiti upotrebom različitih DNA polimeraza visoke vjernosti. Među svim dosad pronađenim Taq DNA polimerazama, Pfu enzim ima najmanju stopu pogrešaka i najveću vjernost (vidi priloženu tablicu). Osim odabira enzima, istraživači mogu dodatno smanjiti brzinu mutacije PCR -a optimiziranjem reakcijskih uvjeta, uključujući optimiziranje sastava pufera, koncentraciju termostabilne polimeraze i optimiziranje broja ciklusa PCR -a.

    Ovdje napišite svoju poruku i pošaljite nam je